Factores fisicoquímicos que influyen en la producción de bioplásticos tipo PHA en
el género Bacillus spp
Angie Daniela Ramirez Alvarez
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
Facultad de Ciencias de la Salud
Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico
Bogotá, abril 2023
Factores fisicoquímicos que influyen en la producción de bioplásticos tipo PHA
en el género Bacillus spp
Angie Daniela Ramirez Alvarez
Asesor
MSc Johanna Marcela Moscoso G.
Asesor Interno
MSc Jovanna Acero Godoy
Asesor Externo
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
Facultad de Ciencias de la Salud
Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico
Bogotá, abril 2023
1
Factores fisicoquímicos que influyen en la producción de bioplásticos tipo PHA
en el género Bacillus spp
APROBADA ________________
JURADOS _________________
ASESORAS __________________
Universidad Colegio Mayor De Cundinamarca
Facultad de Ciencias de la Salud
Programa De Bacteriología
Trabajo De Grado
Bogotá, abril 2023
2
Agradecimiento
Sabiduría es el uso correcto del conocimiento
Quiero dedicar este trabajo principalmente a Dios, fuente de todo el conocimiento
También quiero agradecer a mis padres por su apoyo, comprensión y sacrificio a lo
largo de todos estos años, gracias a ustedes he llegado hasta aquí y me he convertido en
lo que soy hoy en día.
Asimismo, quiero agradecer a mi hermano y amigos por su presencia constante y su
apoyo a lo largo de esta etapa de mi vida.
Quiero expresar mi gratitud hacia la universidad por brindarme las herramientas
necesarias para poder desarrollar este proceso, y por último a mis asesoras Johanna
Marcela Moscoso y Jovanna Godoy por aceptar este reto junto conmigo, por guiar esta
investigación y formar parte de esta etapa.
¡Gracias por todo!
3
Tabla de contenido
1. Resumen 6
2. Abstract 7
3. Introducción 8
4. Objetivo 9
4.1 Objetivo general 9
4.2 Objetivos específicos 9
3. Antecedentes 10
4. Marco teórico 14
4. 1 Plásticos convencionales 14
4.1.1 Historia 14
4.1.2 Clasificación del plástico 18 15
4.1.2.1 Origen 17 15
4.1.2.2 Estructura molecular17 15
4.1.2.3 Respuesta termo-mecánica18 16
4.1.3 Marco Legal 16
4. 2 Biopolímeros 17
4.2.1 Clasificación de los biopolímeros 18
4.2.2 Polihidroxialcanoatos (PHA) 19
4.2.2.1 Clasificación de PHA 20
4.2.2.2 Rutas de biosintesis 21
4.2.2.3.2 Características genéticas de Bacillus cereus 25
4.2.2.4 Tecnicas de deteccion cuntificación y caracterización del PHA 26
4.2.2.5 Fermentación para producir PHA 26
4.2.2.5.1 Fuentes de carbono alternativas 27
4.2.2.6 Extraccion del PHA 27
4.2.2.7 Biodegradación del PHA 28
4.2.2.8 Aplicaciones del PHA 28
5. Diseño metodológico 30
5. 1 Tipo de estudio 30
5.2 Universo 30
7.097 artículos científicos o trabajos de grado en idioma inglés y español de la
base de datos Nature, Oxford academic, Sage journals, Scopus, Taylor and
Francis Group y Google Scholar relacionados con polihidroxialcanoatos (PHA)
y género Bacillus 30
5.3 Población 30
5.4 Muestra: 30
5.5 Criterios de inclusión: 30
5.6 Criterio de exclusión: 30
5.7 Herramienta estadística: 31
6. Resultados 33
6.1 Condiciones fisicoquímicas 44
6.2 Rutas metabólicas y enzimas empleadas en por Bacillus spp. 46
4
6.3 Fuentes de carbono alternativas. 48
6.4 Extracción y tratamiento de PHA 48
6.5 Limitaciones y beneficios de la producción de PHA 49
7. Discusión 52
8. Conclusiones 54
9. Referencias bibliográficas 55
5
1. Resumen
Los plásticos de origen petroquímico son usados deliberadamente y su demanda ha
aumentado, lo que ha generado más residuos que afectan el medio ambiente debido a la
demora en su degradación y emisión de toxinas. Estos residuos llegan a corrientes
hídricas y causan daños en los animales.
Por eso, se han estudiado los PHA; plásticos biodegradables producidos por bacterias y
hongos gracias a su metabolismo y genética. Uno de los microorganismos con esta
capacidad es Bacillus spp. Estos biopolímeros son biodegradables y producen
moléculas benéficas para el suelo, pero no son viables para la industria debido a sus
altos costos de producción por requerir fuentes de carbono ricas en carbohidratos.
Se realizó una revisión sobre la producción de plásticos biodegradables a partir de
diferentes fuentes de carbono por medio del Bacillus spp. Donde se describe el proceso
metabólico y genético que realiza este microorganismo. Asimismo, la implementación
de diferentes fuentes de carbohidratos alternativas como lo son residuos de la industria
agrícola y alimentaria, para poder proporcionar alternativas sostenibles y que reduzcan
costos a la industria de los plásticos. Tras la revisión bibliográfica de 53 artículos de
diferentes bases de datos reconocidas, se concluye que el género Bacillus spp, tiene
gran potencial variando las condiciones fisicoquímicas como la temperatura, pH,
relación carbono nitrógeno y fuente de carbono fermentable con el que se desarrolle. Se
ha registrado el uso de residuos industriales tales como aceite de canola y residuos de
uva, como carbohidrato fermentable.
Palabras clave: Bacillus cereus, polihidroxialcanoatos (PHA), biopolímeros, gen de la
PHA sintasa, plásticos petroquímicos
6
2. Abstract
Plastics of petrochemical origin are used deliberately and their demand has increased,
which has generated more waste that affects the environment due to the delay in its
degradation and the emission of toxins. These residues reach water currents and cause
damage to animals.
For this reason, PHAs have been studied; biodegradable plastics produced by bacteria
and fungi thanks to their metabolism and genetics. One of the microorganisms with this
ability is Bacillus spp. These biopolymers are biodegradable and produce beneficial
molecules for the soil, but they are not viable for the industry due to their high
production costs as they require carbon sources rich in carbohydrates.
A review was carried out on the production of biodegradable plastics from different
carbon sources by means of Bacillus spp. Where the metabolic and genetic process
carried out by this microorganism is described. Likewise, the implementation of
different sources of alternative carbohydrates such as residues from the agricultural and
food industry, in order to provide sustainable alternatives that reduce costs to the
plastics industry. After the bibliographic review of 53 articles from different recognized
databases, it is concluded that the genus Bacillus spp has great potential by varying the
physicochemical conditions such as temperature, pH, carbon nitrogen ratio and
fermentable carbon source with which it develops. Industrial residues such as canola oil
and grape residues have been reported for use as a fermentable carbohydrate.
Keywords: Bacillus cereus, polyhydroxyalkanoates (PHA), biopolymers, PHA
synthase gene, petrochemical plastics
7
3. Introducción
Los plásticos convencionales se han desarrollado desde la antigüedad para poder
solucionar diversos problemas que afectan a la humanidad. Por tal razón, las industrias
se han dedicado al mejoramiento de estos productos, desarrollaron fórmulas que
permiten obtener mayor volumen de plástico a un menor precio1. Sin embargo, estos
compuestos, por su origen sintético, su degradabilidad es cuestionada pues es demorada
y al realizar este proceso generará partículas tóxicas para el medio ambiente2. La
inadecuada disposición de estos residuos en diversos ecosistemas puede alterarlos,
ocasionando serios problemas y afectaciones en la flora y fauna.
Debido a esto, una gran cantidad de investigaciones se han desarrollado buscando
alternativas sostenibles que puedan reducir los efectos del plástico y crear productos
que puedan llegar a reemplazarlo. Los polihidroxialcanoatos son uno de estos
descubrimientos, donde se han encontrado microorganismos tales como bacterias
pueden producirlo en su interior. Una de las grandes ventajas del polímero es su
biodegradabilidad2.
Los costos de producción de los polihidroxialcanoatos a partir de microorganismos son
elevados y los tiempos que conlleva la producción son extensos. Por ello, se han
buscado alternativas sostenibles usando otras fuentes de carbohidratos no
necesariamente sintéticos, como por ejemplo, los residuos de las industrias agrícolas y
alimentarias, y poder reducir el costo de producción de estos bioplásticos3.
Bacillus spp es uno de los microorganismos más conocidos en la producción de
polihidroxialcanoatos. Por ello se estudiarán los factores fisicoquímicos que influyen en
el crecimiento del microorganismo y la producción de bioplásticos tipo PHA en el
género Bacillus spp3.
8
4. Objetivo
4.1 Objetivo general
Realizar una revisión sistemática sobre producción de plásticos biodegradables a partir
de Bacillus spp. variando diferentes condiciones fisicoquímicas tales como la
temperatura, el pH, la relación carbono nitrógeno y la fuente de carbono fermentable del
medio.
4.2 Objetivos específicos
- Analizar la influencia de los factores fisicoquímicos en la producción de
bioplásticos tipo PHA en el género Bacillus spp., mediante la investigación y el
uso de diversas herramientas de literatura y tecnología.
- Describir el proceso metabólico y genético que lleva a cabo Bacillus spp para
integrar diferente fuente de carbono, incluyendo las enzimas y vías metabólicas
involucradas y las condiciones óptimas para su crecimiento.
- Analizar el proceso de aprovechamiento de fuentes de carbono para la
producción de polihidroxialcanoatos, incluyendo las etapas de extracción,
purificación y transformación, así como los beneficios y limitaciones de este
proceso para la producción sostenible de bioplásticos.
9
3. Antecedentes
La Federación de Sociedades Europeas de Microbiología1 en 1992, menciona la
producción de polihidroxialcanoatos (PHA), los cuales son compuestos poliésteres
producidos por microorganismos. El más estudiado y simple de los PHAs es el
polihidroxibutirato (PHB). La ventaja de estos poliésteres es que se degradan en el
suelo siendo beneficioso para futuros cultivos o plantas cercanas. Este polímero, como
se mencionó anteriormente, es creado por microorganismos que pueden sintetizar
bioplásticos; los cuales tienen la capacidad de almacenarlo dentro de sí mismo hasta un
80% más de su mismo peso.
En el año 2002 Borah2, se dedicó a la optimización de condiciones nutricionales y
ambientales para Bacillus mycoides con el objetivo de mejorar la producción de
polihidroxibutirato. En este estudio Borah utilizó diferentes fuentes de carbohidratos
fermentables para el microorganismo y así mismo sus diferentes condiciones químicas
como suplementos de nitrógeno, sodio y la aireación. Se estableció que la disminución
de producción de PHB se da por exceder el tiempo de incubación de las bacterias
después de llegar a su fase de reposo, ya que usarán el PHB como fuente de energía y
carbono. En esta investigación sus autores establecen tres funciones de gran
importancia que cumple la fuente de carbono: es una fuente de carbono para la síntesis
de biomasa, una fuente de energía para la biosíntesis y el mantenimiento celular, y
como consecuencia, permite la polimerización de PHB. El uso de fuentes de nitrógeno
promueve el rendimiento y la productividad de PHB, por tal razón se buscan diversas
alternativas económicas y de calidad.
Moreno3, en el año 2006, estandarizó una técnica de recuperación de biopolímeros
presentes en la bacteria Pseudomonas putida, por medio de hipoclorito de sodio y
cloroformo. Estas sustancias buscan degradar el material celular y poder solubilizar el
polímero, para así poder lograr una excelente extracción de éste. Dentro del artículo se
estudia la calidad del plástico que se obtiene variando diferentes concentraciones de
hipoclorito-cloroformo, temperatura y tiempos. Para poder obtener el 96% de pureza en
el biopolímero se recomienda que la concentración de hipoclorito sea del 5.0% p/v, su
tiempo de extracción sea 60 minutos a 60 ºC para conservar su peso molecular.
En ese mismo año Madigan4, aisló microorganismos del género Bacillus spp de un lago,
donde planteó como hipótesis la producción de plásticos usando melaza de soya como
fuente de carbono fermentable para las bacterias. Cabe resaltar, que la producción de los
plásticos que se han abordado a lo largo del proyecto no es de fácil implementación, ya
que la materia prima suele ser muy costosa, razón por la cual, se estudian las
posibilidades de usar restos vegetales industriales con disponibilidad de nitrógeno como
glutamato, aspartato, glutamina y urea con el fin de reducir los costos. Madigan
determinó que el tiempo de crecimiento de las bacterias es mínimo de 24 horas a pesar
de las condiciones anóxicas, al momento de observar en el microscopio se evidencia
presencia de esporas. Las especies de Bacillus aisladas, brindaron resultados superiores
10
al crecimiento de los cultivos registrados en la literatura por géneros utilizados a nivel
industrial como lo es la bacteria Alcaligenes spp.
En el año 2008, González5 , realiza el aislamiento de Bacillus obtenido de aguas marinas
el cual tiene la capacidad de sintetizar PHA. Asimismo, explica las características y las
condiciones necesarias tanto para la producción de biomasa, como la producción del
polímero (sacarosa, glucosa, peptona y extracto de levadura). Al momento de realizar la
extracción de bioplástico intracelular, implementa dos métodos diferentes; por medio de
extracción por solventes y extracción química por digestión, donde recomienda el uso
de solventes para no alterar la producción de polímeros, en cuanto a la concentración de
nitrógeno se observó un mejor crecimiento a una concentración 1.0 g/L.
En el año 2013, González et al6 explica el proceso de síntesis de poliésteres por algunos
microorganismos los cuales se sintetizan de manera intracelular como reserva de
carbono y de energía. Dentro de los polímeros obtenidos está el ácido hidroxialcanoico
(producido por bacterias, arqueas y microalgas). En las investigaciones se logró
observar el crecimiento de gránulos, los cuales se formarán en el citoplasma de dichas
bacterias, sin embargo, existen condiciones que determinarán la cantidad de producción
de estos gránulos de PHA al interior de la célula. Este tipo de plástico biodegradable es
respuesta a necesidades de la industria biomédica, agricultura, productos higiénicos y
empaques. Actualmente, en latinoamérica, México y Brasil son pioneros en la
utilización de este plástico gracias a la empresa Biocycle.
Pradhan7 en el año 2014, separa en dos grupos las bacterias productoras de PHA según
su alimentación, el primer grupo son aquellas que requieren limitaciones de nutrientes
esenciales como C. necator o Protomonas extorquens y el segundo son aquellas que no
requieren limitaciones en su nutrición como una cepa mutante de Azotobacter
vinelandii, E. coli recombinante y Bacillus cereus. Este último fue aislado de residuos
de la ciudad de Rourkela en la India. B. cereus se sembró utilizando distintas fuentes de
carbono como dextrosa, lactosa, sacarosa, maltosa, fructosa y galactosa por 3 días a
37°C a 150 r.p.m en un agitador rotatorio. Posteriormente extrajo el PHA con
hipoclorito de sodio y se utilizaron diferentes técnicas de caracterización como
espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) y difracción de rayos X
(XRD). Al tener estos resultados, se menciona que este plástico es quebradizo y sugiere
la combinación con otros polímeros para poder mejorar su calidad. Se pudo evidenciar,
que la implementación de la maltosa como fuente de carbono generó mayor
producción de biomasa y bioplástico, respectivamente 0,097g/2 ml y 0,563g/100 ml.
En el año 2015, Lemos8 específica los beneficios de los polihidroxialcanoatos, ya que se
posicionan a nivel industrial debido a su variedad farmacéutica, biomedicina, de
alimentos, embalaje, entre otras., por tal razón se escoge al momento de empacar
diversos productos. Estos biopolímeros se desarrollan de manera intracelular en
microorganismos, medio de un proceso denominado polimerización de ácidos
hidroxialcanoatos, por acción de enzimas intracelulares, tiene lugar mediante
condensación del grupo carboxilo de un monómero (ácido hidroxialcanoato), con el
11
grupo hidroxilo del siguiente, formándose un enlace éster; de ahí que reciben el nombre
de biopoliésteres. Establece cómo a partir de las variaciones en la cadena lateral o el
radical se van a presentar variaciones en sus características y con ello se genera una
clasificación.
En ese mismo año Muhammadi9, afirma que el PHA será la nueva generación de
polímeros, en este escrito la autora explica la estructura de este polímero, la detección
de bacterias que pueden producir el plástico, la diversidad que se encuentran en estas
bacterias, la síntesis, la formación in vitro e in vivo de estos gránulos, la estructura, sus
diversos métodos de extracción, la biodegradabilidad, sus propiedad físicas y tambien
como podria sustituir las plásticos de origen petroquímico en las diversas industrias.
Posteriormente, en el año 2019, Mohammed10, aisló bacterias de un vertedero de
plásticos y a partir de ellas produce polímeros intracelulares. Dentro de sus objetivos
estuvo evaluar el aislamiento de las bacterias productoras de PHA y confirmar la
acumulación de plástico intracelular por medio del uso de tinciones como es el negro de
Sudan y la coloración con azul de Nilo y rojo de Nilo, identificar y caracterizar las
bacterias utilizando pruebas bioquimicas y 16rRNA y por ultimo evaluar si eficiencia
como fuente de carbono, para asi mismo poder extraer el polimero. En esta
investigación se pudo aislar bacterias del género Bacillus sp. BPPI-14 y Bacillus sp.
BPPI-19 usando D-fructosa, glucosa, melaza, D-ribosa y glicerol puro como fuente de
carbono, obteniendo de la glucosa 49.5 ± 2.79% de polihidroxialcanoatos y con una
49.5a ± 2.79 % de productividad de polihidroxialcanoatos.
Bhagowati11 publicó en 2015. Donde menciona que el poli-β-hidroxibutirato es una
reserva de lípidos intracelulares que acumulan muchas bacterias. Bacillus cereus SE-1
aislada del suelo, mostró más células acumuladoras de PHB que Bacillus sp. marino.
SE-1. Por lo tanto, mezclar PHB con otros polímeros mejora económicamente sus
propiedades mecánicas. Durante este estudio, se utilizó almidón termoplástico para
aumentar las propiedades mecánicas de la muestra de PHB. Mezclar PHB con otros
polímeros beneficiará su reducción de costos, además de mejorar sus propiedades
termoplásticas.
En el año 2021 Andler12 pública, en el cual explica el proceso para la producción de
bioplástico por medio de la bacteria Bacillus cereus, usando residuos de uvas como
fuente de carbono. A lo largo del artículo, se desarrolla el proceso de incubación de la
bacteria ya que primero realizó la hidrólisis del orujo de la uva para incubar las
bacterias por 72 horas con fuentes de carbohidrato hidrolizado, otras directamente con
el residuo vegetal y otra fue cultivada con glucosa como cultivo control. Explica el
método de extracción de polímeros el cual fue hipoclorito cloroformo. Se realizó
cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para realizar un análisis
cualitativo del PHB extraído, se logró una concentración celular de 7,86 g L-1 y una
concentración de PHB de 4,03 g L-1, donde se confirma la presencia de PHB
metanolizado en las muestras analizadas.
12
En Singapur, Addagada L13 en el 2022, menciona una prometedora alternativa que
ofrecen los biopolímeros para reducir la contaminación ambiental causada por los
residuos plásticos. Resalta su naturaleza similar al caucho y características de
biocompatibilidad, biodegradabilidad, ecológicas, renovables y producidas
biológicamente las cuales son una gran ventaja. A pesar de que el alto costo de
producción y bajo rendimiento pueden limitar su producción a gran escala, por ende
numerosos investigadores están trabajando en la utilización de fuentes de carbono
basadas en residuos o subproductos y en la explotación de microorganismos
genéticamente modificados para resolver estos problemas o modificaciones a los
medios y condiciones de cultivo, por ellos indica dos factores imprescindibles para
poder desarrollar esta biotecnología, como es la proporción de carbono a nitrógeno
(C:N) y al glicerina cruda presente en el medio de cultivo.
13
4. Marco teórico
4. 1 Plásticos convencionales
Los plásticos son derivados del petróleo, que pueden ser moldeados por
condiciones químicas y físicas gracias a las macromoléculas que lo componen,
como se observa en la figura 1. Aunque en la antigüedad eran producidos por
medio de fuentes naturales. En el transcurso del tiempo, se desarrollaron
diferentes métodos para lograr realizar la producción a escala y diversificar sus
usos, con características más tenaces14 . La unión de la calidad, variedad y bajos
precios generó un incremento en la demanda de este producto alrededor del
mundo. Tal ha sido, que se puede encontrar en la mayor cantidad de objetos y
lugares que se usa en la vida diaria como envases de productos de aseo personal,
implementos de cocina, bolsas, entre otros usos15.
Figura 1: Estructura de los polímeros en función de la funcionalidad de los monómeros.
Fuente: Carrasquero FL. 2005
4.1.1 Historia
Los polímeros desde la antigüedad se han estado estudiando con el fin de poder
dar soluciones a las necesidades de los humanos. El látex fue descubierto por
pueblos americanos y usado para la creación de pelotas, esto atrajo las miradas
de los europeos y países del primer mundo. Tras el descubrimiento de la
vulcanización se desarrolló la industria del caucho y a lo largo del siglo XIX se
dieron los descubrimientos de la nitrocelulosa, el colodión, el celuloide y la
dinamita. En el siglo XX, ocurrieron avances importantes como la reacción
entre el fenol y el formaldehído para poder dar lugar a la resina termoestable,
donde los científicos creyeron que los polímeros eran agregados moleculares y
14
tenían como resultado fuerzas de atracción las cuales mantenían unidos los
componentes16.
En la década de los 30´s el científico Du Pont Wallace Hume Carothers logra
obtener la primera fibra sintética denominada Nylon y desde ese punto hubo una
aceleración en los descubrimientos e investigaciones orientadas a la síntesis del
plástico16.
4.1.2 Clasificación del plástico18
Los polímeros se han estudiado en tal medida que han permitido tener toda una
gama de características para escoger dependiendo de su origen y sus usos.
Como se puede resumir en el mapa conceptual de la figura 2.
4.1.2.1 Origen 17
- Naturales: Son todos aquellos que provienen directamente de un reino vegetal o
animal, por ejemplo: la seda, la lana, el algodón, la celulosa, el almidón, el
caucho natural como el látex, entre otros.
- Sintéticos: Son aquellos que son producidos por el hombre y derivados del
petróleo, carbón o gas natural.
- Semisintéticos: Se definen como los polímeros que son el resultado de una
mezcla entre polímeros sintéticos y biológicos
4.1.2.2 Estructura molecular17
Los polímeros son uniones de monómeros que posteriormente formarán
macromoléculas y según sus enlaces se podrá clasificar en:
- Lineal:Está formado por cadenas largas de macromoléculas no ramificadas y
tiene el mismo tipo de unión, son consideradas cadenas principales de donde se
derivan las cadenas secundarias.
- Ramificadas: Son las cadenas laterales que están conectadas a la cadena
principal.
- Entrecruzadas: Es el producto de la formación de enlaces covalentes entre
cadenas principales adyacentes en diferentes posiciones.
- Homopolímeros: Se definen como la unión de monómeros que lo constituyen
son iguales.
- Copolímeros o heteropolímeros: Se clasifica así a la unión de dos o más
monómeros diferentes.
15
4.1.2.3 Respuesta termo-mecánica18
La respuesta termomecánica de un plástico está relacionada con su comportamiento
ante cambios de temperatura y cargas mecánicas aplicadas. Este fenómeno está
directamente influenciado por la estructura química y la morfología del plástico.
- Termoplásticos: son polímeros que molecularmente están formados por
cadenas lineales y de alto peso molecular. Por ello, al momento de aplicar calor
al polímero tiene características plásticas, es decir se deforma; pero no se
modifican sus enlaces moleculares. De tal manera que son plásticos que se
pueden volver a dar diferentes formas sinnúmero de veces. Por ejemplo los
polietilenos (PE), polipropileno (PP), poliéster (PET), poliamida o nylon (PA).
- Termorrígidos: Son polímeros termoestables que han sido sometidos a un
proceso llamado degradación, que por diferentes métodos los cuales generan
interrupciones entre los enlaces covalentes producen los radicales libres, este
proceso causa la unión entre cadenas adyacentes formando una especia de malla
y esto los hace más resistentes; estos plásticos no puedan ser reprocesados. Por
ejemplo poliuretano,y algunos tipos de resinas.
- Elastómeros: son aquellos polímeros que cuentan con estructura molecular
lineal o reticular, estos forman cadenas largas las cuales son ordenadas de
manera en la que se enrollan entre sí, en caso de que se genere una fuerza de un
agente externo estas cadenas se extiende de manera que brindan elasticidad,
pero cuando se elimina la fuerza del agente externo vuelve a su forma inicial de
manera instantánea. No se pueden derretir o cambiar su estado físico debido a su
composición. Por ejemplo el caucho o las siliconas.
4.1.3 Marco Legal
Colombia contaba con un retraso en políticas públicas que protejan al medio ambiente
frente a su disposición y limiten la fabricación y el uso de plásticos de origen
petroquímico. En 2018, se presentó un proyecto de ley el cual buscaba regular la
fabricación, comercialización y distribución de elementos de un solo uso para el
consumo de alimentos y bebidas, con el fin de reducir el impacto negativo que generan
estos productos en los ecosistemas acuáticos y el medio ambiente en general. Donde el
derecho al medio ambiente ha sido vulnerado por el uso de plásticos de un solo uso.
También menciona cómo diferentes actores del medio ambiente se ven afectados por el
mal uso de estos productos19. En el año 2022 se aprobó la ley 223220, la cual tiene por
objeto resguardar la salud de los ciudadanos y del goce del medio ambiente. Se
establecen medidas para reducir la producción y consumo de plásticos de un solo uso.
En este documento legal se mencionan diferentes sustituciones graduales para poder
adoptar alternativas sostenibles, también se establecen tiempos para poder eliminar su
uso y especifican en qué lugares no se puede hacer uso de plásticos de un solo uso.
16
4. 2 Biopolímeros
Se trata de plástico producido a partir de materias primas renovables o de origen
orgánico. Por ello, al finalizar su vida útil algunos se suelen convertir en materia
orgánica, su tiempo de degradación es corto y además de ello puede generar nutrientes.
El tratamiento de los plásticos convencionales como el soplado, extrusión e inyección
suelen ser usados en estos. La demanda de estos plásticos ha sido impulsada ya que al
poder degradarse disminuye la producción de residuos por los humanos. No obstante,
por sus diferentes formas de producción su valor tiende a incrementar un poco, en
contraposición, brinda soluciones ecológicas. Se debe tener en cuenta que los
biopolímeros se clasifican según su forma de síntesis1,22,22.
Figura 2: Clasificación de los polímeros.
Fuente: Carrasquero FL. 2005
17
4.2.1 Clasificación de los biopolímeros
- Polímeros bio quimiosintéticos21: los monómeros son sintetizados
naturalmente y químicamente se polimerizan. Un ejemplo de ellos es el
Poli(ácido láctico) (PLA), el cual es un plástico sintético termoplástico,
producido a partir del ácido láctico por fermentación anaerobia de substratos
que tengan carbono ya sea de monosacáridos como la glucosa o polisacáridos
como el almidón. Estas moléculas (PLA) son producidas por bacterias y hongos
gracias a un proceso denominado polimerización por condensación, el cual
utiliza temperaturas mayores de 12 ºC o catalizadores químicos22, esto con el fin
de obtener polímeros de bajo peso molecular. El PLA se caracteriza porque sus
propiedades mecánicas son buenas en comparación con otros polímeros
termoplásticos (PET). Gracias a ello, es usado en envases de grasas y aceites;
también es usado en aplicaciones biomédicas gracias a su biocompatibilidad y
biodegradabilidad. Este producto es altamente biodegradable6, en condiciones
controladas como temperatura y humedad una película de P3HB se demora 5
días en degradar el 90%,(produciendo dióxido de carbono y agua), sin producir
moléculas cancerígenas6.
- Polímeros biosintéticos: Son los plásticos que se desarrollan en el interior de
las células bacterianas como reserva de energía. Su proceso de unión de
monómeros y polimerización se dan en el citoplasma, necesitan una
modificación química y/o física para poder mejorar su estructura, propiedades
térmicas o mecánicas. Es totalmente biodegradable y presenta degradación
enzimática o hidrolítica sin producir desechos tóxicos para el ambiente9.
- Polímeros naturales modificados: son aquellos que están formados por una
mezcla entre polímeros obtenidos a partir del almidón o la celulosa y plásticos
convencionales con el fin de reforzar sus funciones entre sí y mejorar su proceso
de biodegradación. Desafortunadamente, estos biopolímeros no suelen ser
biodegradables, ya que hay microorganismos que tiene la capacidad de degradar
el almidón o la celulosa lo cual ayuda en la reducción del tiempo de
degradación parcial, ya que los productos de la degradación del almidón o de la
celulosa son recalcitrantes y pueden estar en el medio ambiente por períodos
largos del tiempo6.
4.2.2 Polihidroxialcanoatos (PHA)
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros compuestos por ácidos
hidroxialcanoatos (ver figura 3), algunas bacterias, arqueas y microalgas acumulan en el
interior de su citoplasma rodeados de una monocapa de fosfolípidos, como material de
reserva con el propósito de usar después como fuente de carbono y de energía1, como
se observa en la figura 4 .Esto es un efecto de la polimerización de los ácidos
hidroxialcanoicos por las enzimas polimerasas y despolimerasas, las cuales mediante la
condensación del grupo carboxilo de un monómero con un grupo hidroxilo de la
18
siguiente molécula formando un enlace éster, como evidencia en la imagen 3. Una de
las condiciones por las cuales se sintetiza PHA en la bacteria es en respuesta a una
limitación de elementos importantes para su supervivencia como lo son el nitrógeno, el
potasio, el magnesio, el azufre o el oxígeno. El gránulo de PHA que se desarrolla en el
interior de la célula está compuesto por una membrana de fosfolípidos donde se
encuentran las enzimas de polimerasas y despolimerasas. En diferente literatura,
afirman que el número de gránulos por célula se define en el en las etapas de
acumulación y cuando la producción de este polímero alcanza cerca del 80% del peso
celular se detiene (figura 5), por lo cual se puede afirmar que se evidencia restricciones
físicas que impiden a la bateria acumalar mas plastico, sin importar que aun tenga
disponibilidad de sustrato y la actividad enzimática esté activa6, 24.
Figura 3: Estructura general de los PHA
Fuente: Lemos AC, Mina A. 2015
Figura 4: Esquema del gránulo de PHA acumulado intracelularmente. Se aprecia la membrana
que lo rodea en la que se encuentran enzimas polimerasas y despolimerasas
Fuente: Lemos AC, Mina A. P 2015
Figura 5: Micrografía electrónica de transmisión de sección delgada a través de una célula en
división cultivada aeróbicamente en rafinosa. Obsérvese las inclusiones de PHA (flechas).
Fuente: Full TD, Jung DO, Madigan MT. 2006
19
La degradación aeróbica del PHA puede conducir a la mineralización completa de CO2
y agua, y su degradación anaerobia podría generar metanol y posteriormente vender
como combustible23.
La implementación de estos plásticos, como ya lo mencionamos, son los costos1 de la
materia prima ya que inicialmente se usaba glucosa pura como fuente de carbono y los
proceso de extracción y purificación del polímero por diversos métodos solían ser
dispendiosos. Por tal razón, con el tiempo se ha propuesto implementar el uso de
biomasa con alta presencia de carbohidratos como fuente de carbono fermentable para
estos microorganismos25.
4.2.2.1 Clasificación de PHA
Los PHA se pueden clasificar de acuerdo al tamaño de su cadena molecular. Sin
embargo, es importante tener en cuenta que pueden presentar homopolimeros y
copolimeros dependiendo la fuente de carbono y el microorganismo que esté en
estudio26. Como se observa en la figura 6.
- PHA de cadena corta (PHA-scl): es aquella que está compuesta por
monómeros que tienen de 3 a 5 átomos de carbono. Son polímeros
termoplásticos, es decir que pueden ser moldeables, los integra copolímeros para
poder ser más versátiles.
- PHA de cadena media (PHA-mcl): está compuesta por monómeros de 6 a 14
átomos de carbono, Se denominan también amorfos lo que le da una una
clasificación de elastómero
- PHA mixtos: está compuesto por monómeros de cadenas cortas y cadenas
media. una reducida población de bacterias tiene la capacidad de poder producir
este.
Figura 6: Clasificación de los PHA según su composición monomérica
Fuente: Lemos AC, Mina A. Polihidroxialcanoatos (PHA’s) producidos por bacterias y su posible
aplicación a nivel industrial. 2015
20
4.2.2.2 Rutas de biosintesis
La síntesis de PHA en bacterias está asociada con múltiples genes y rutas metabólicas,
en las cuales la presencia de Acetil-CoA es crucial para la obtención de
(R)-hidroxialcanoil-CoA. La elección de la ruta metabólica depende de la maquinaria
enzimática y del sustrato utilizado, siendo los azúcares y los ácidos grasos las fuentes de
carbono más comunes (Figura 7). Las principales enzimas que participan en la síntesis
de PHA son phaA, phaB, phaC, phaG y phaJ25. Lo más importante al momento de
realizarse la síntesis del polímero, es el destino de la acetil-CoA, donde se puede usar
como sustrato para la síntesis del P3HB o ser oxidada en el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos. Este proceso es dependiente de las condiciones ambientales y
especialmente de la limitación de oxígeno, ya que puede aumentar la relación de
NADH/NAD. La citrato sintetasa y la isocitrato deshidrogenasa se inhibe por el NADH
y por tal razón no entra al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, por lo cual es transformada
a acetoacetil-CoA por la 3-cetotiolasa que a su vez es inhibida por CoA. Los
microorganismos que tienen la capacidad de producir PHA de cadena corta
normalmente solo pueden producir este tipo de PHA, sin embargo en caso de
desarrollar microorganismos recombinantes se podrían obtener PHA de cadena corta,
media e híbridas. diferentes autores relacionan la formación de PHA como un sumidero
de poder reductor de las bacterias, lo cual actúa como un regulador redox en el interior
de la célula.(Figura 8)
En la producción de PHA de cadena media genéticamente, están presentes los genes en
el operon phaC1zC2D, los cuales codifican para la producción de dos polimerasa, una
despolimerasa y la proteína PhaD. Las polimerasas tienen la función de catalizar la
condensación de PHA de varios derivados de 3-hidroxiacil-CoA con cadenas entre 6 y
14 carbonos28. Los intermediarios presentes en este proceso se obtienen por medio de
una B-oxidación o por medio de otras rutas metabólicas se pueden generar los
monómeros (Figura 9). La concentración de la enzima PHA sintetitaza en el sustrato
juega un papel importante al momento provisionar 3-hidroxiacil-CoA tioesterasa la ruta
metabólica, ya que esta enzima determina la masa molecular y la composición del
biopoliester, que también se puede afectar por la presencia de despolimerasa, esterasas y
lipasas específicas que hidrolizan el polímero que ya ha sido acumulado, dentro de los
factores que influyeron está el nivel de expresión de la proteína de PHA sintasa activa29.
El potencial metabólico del microorganismo y la especificidad de sustrato de la PHA
sintetasa influyen estrictamente en la composición del PHA ya que se debe realizar la
promoción de (R) 3-hidroxiacil-CoA tioésteres a partir de la de fuente de carbohidrato
usado6,26,29.
4.2.2.3 Microorganismos productores de PHA
Las bacterias más conocidas por esta características son Ralstonia eutropha,
Rhodobacter spp, Azospirillum spp31., Azotobacter spp32, Methylocystis spp33,
Leptothrix spp34, Pseudomonas spp3., Rhizobium spp., entre otras28,30,35,.
21
Bacillus megaterium, fue la primera bacteria productora de PHA descubierta en 1926
por Maurice Lemoigne, pero al pasar de los años la investigación de este tema ha sido
mucho más profunda al punto que se han determinado más de 300 bacterias capaces de
producir PHA. Sin contar que también se estudia que algunos hongos también tengan
esta capacidad. En las bacterias no solo se limita a un tipo de bacteria, es decir que tanto
bacterias Gram negativas y Gram positivas tienen esta características. Al tener gran
variedad de bacterias productoras, también aumenta la variedad en cada plástico
producido por ellas. Actualmente se realizan investigaciones para realizar mejoras
genéticas o desarrollar microorganismos recombinantes para poder mejorar la
producción, rapidez y eficiencia de este producto30.
Figura 7: Biosíntesis de PHAs.
Abreviaciones: PhaA, 3-cetotiolasa; PhaB, (R)-3-cetoacil-CoA reductasa (para la biosíntesis de PHB, la enzima es
acetoacetil-CoA reductasa); PhaC, PHA sintasa o polimerasa; PhaG, (R)-3-hidroxiacil ACP: CoA transacilasa; PhaJ,
(R)- específica enoil-CoA hidratasa. PhaC, específica para monómeros enantioméricos en la configuración [R].
Fuente: Otero-Ramírez ID. Bioprospección de bacterias productoras de polihidroxialcanoatos (PHA’s) en el
departamento de Nariño, 2019
22
Figura 8: Ruta metabólica para la síntesis y degradación intracelular de P3HB a partir de carbohidratos. Se
indican las principales enzimas implicadas en el proceso
Fuente: Lemos AC, Mina A. 2015
Figura 9:Ruta para la síntesis de PHA de cadena media en Pseudomonados. Se presenta la vía a partir de
ácidos grasos y a partir de carbohidratos
Fuente: Lemos AC, Mina A. 2015
23
4.2.2.3.1 Bacillus cereus
Bacillus cereus es una bacteria que pertenece al género Bacillus spp, en el microscopio
se observa como una bacilo gram positivo, anaerobio facultativo con motilidad, tiene la
capacidad de producir esporas termotolerantes36. Es de importancia clínica e industrial,
ya que puede llegar a ser altamente virulenta para el ser humano, se puede ingerir por
medio de alimentos que no han tenido un tratamiento térmico. Para evitar la
contaminación por este microorganismo, se recomienda cocinar la comida por encima
de los 50 ºC. Este es un microorganismos que tiene la capacidad de sintetizar plástico
biodegradable, ya que acumula en su citoplasma gránulos de PHA, sus cadenas son
lineales y de bajo peso molecular ya que la energía de este microorganismo también es
repartida para la producción de esporas. El polímero se da en condiciones de estrés es
decir cuando tiene limitaciones en sus nutrientes esenciales. El bioplástico producido
por Bacillus cereus tiene semejanza al plástico de origen petroquímico11.
Para su proceso de crecimiento de PHA se han desarrollado diferentes investigaciones
para poder determinar la viabilidad del uso de otras fuentes de carbono fermentable a
partir de biomasa lignocelulósica, que se define como los desechos agrícolas,
industriales y forestales que significan una potencial fuente de carbono renovable,
además por sus procesamiento previo puede disponer de cantidades potenciales de
azúcares reductores12.
Es importante tener en cuenta, que las bacterias gram positivas tienen la presencia de
una pared celular más gruesa y se requiere mayor energía y procedimientos más
robustos para la extracción del PHA6.
4.2.2.3.2 Características genéticas de Bacillus cereus
En la producción y síntesis de PHA en bacterias se involucran tres enzimas
reguladoras37. Estas enzimas incluyen β-cetotiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y PHA
sintasa/polimerasa, codificadas por phbA, phpbB y phbC, respectivamente38. La
D(-)-3-hidroxibutiril-CoA se forma cuando la reductasa interactúa con la enoil-CoA
hidratasa o la epimerasa, o ambas. Por lo tanto, la presencia del gen phbB en ambos
aislados sugiere que el grupo de genes phb media en la producción de PHA en ellos39.
- Acumulación de precursores: La síntesis de PHA en Bacillus cereus comienza
con la acumulación de precursores metabólicos como los ácidos grasos. Los
ácidos grasos se sintetizan en las células a partir de moléculas de acetil-CoA por
la acción de enzimas como la acetil-CoA carboxilasa y la acil-CoA sintetasa.
Las acil-CoA sintetasas convierten los ácidos grasos en sus respectivos
acil-CoA, que son sustratos para la polimerización de PHA.
- Polimerización: La polimerización de los monómeros de PHA se lleva a cabo
por la acción de una enzima denominada poli(3-hidroxialcanoato) sintasa
(PHAS). En Bacillus cereus, PHAS está codificado por el gen phaC, que forma
parte del operón pha y contiene otros genes implicados en la síntesis de PHA,
24
como phaR, phaP y phaZ. PHAS utiliza acil-CoA como sustrato para catalizar la
formación de enlaces de éster entre monómeros para generar cadenas de PHA.
- Acumular y almacenar: Una vez sintetizado, el PHA se almacena en gránulos
intracelulares y se acumula en las células como almacenamiento de energía y
carbono. Este proceso en Bacillus cereus está regulada por varios genes,
incluidos los genes phaR y phaP. La proteína PhaR actúa como represor de la
expresión génica del operón pha, mientras que la proteína PhaP es responsable
de la formación y estabilización de las partículas PHA40.
4.2.2.4 Tecnicas de deteccion cuntificación y caracterización del PHA
Desde la antiguedad, se ultilizaba el colorante negro de Sudan B ya que es lipofilico,
donde las los colonates se mezclan con lipidos celulares y los tiñe. De manera posterior,
se desarrollan tinciones con mayor afinidad y especificidad en compuestos de
naturaleza lipídica, como lo el el azul Nilo A este es un colorante simple el cual permite
diferenciar los diferentes tipos de grasa y ésteres de colesterol frente a ácidos grasos
libres y fosfolípidos, este genera una fluorescencia naranja a una longevidad de onda de
460 nm. La coloración Rojo nilo es una opción ideal para poder observar las inclusiones
intracelulares, donde también se observa una fluorescencia de amarilla a dorada o de
rosa a roja, dependiendo la longitud de onda.
Otros métodos son las espectrofotometría (FT-IR), método gravimétrico,
espectrofotometría, cromatografía de gases, cromatografía iónica, cromatografía de
gases acoplada a masas, cromatografía de filtración en gel, calorimetría diferencial de
barrido y resonancia magnética nuclear6,37.
4.2.2.5 Fermentación para producir PHA
Dentro del proceso de fermentación se dividen en dos tipos de microorganismos ya que
las condiciones del medio de cultivo varían. Dentro del primer grupo se encuentran los
microorganismos que requieren la limitación de un nutriente esencial, como el
nitrógeno, fósforo, azufre, magnesio y oxígeno, así generar el PHA por un exceso de
fuente de carbohidratos. Para este tipo de bacterias se realiza en dos etapas, donde en la
primera etapa no se limitan nutrientes hasta obtener la concentración de biomasas
deseada y posteriormente se realiza la segunda etapa donde se promueve la síntesis de
PHA manteniendo las limitaciones de las sustancias esenciales, durante esta etapa no se
espera crecimiento biomasa sino acumlacion intracelular del polimero. En algunos
casos solo basta la presencia de glucosa para continuar con la síntesis de PHA o en las
bacterias producen PHA de manera más eficiente cuando uno de los nutrientes está
limitado, pero no completamente consumido.
El segundo grupo de bacterias son aquellas que pueden lograr la producción de PHA en
altas cantidades, de manera que el lote solo sea alimentado en una sola etapa, esta
acumulación de polímeros se da en la fase de crecimiento2,6,41, 42, 43.
25
- Relación Carbono nitrógeno (C/N)
La relación carbono-nitrógeno es una de las relaciones más importantes para entender
cómo los organismos interactúan con su entorno. Los organismos utilizan diferentes
fuentes de carbono y nitrógeno para sintetizar compuestos orgánicos esenciales para su
crecimiento y supervivencia. La relación C/N también puede afectar la calidad de los
suelos y la disponibilidad de nutrientes para las plantas. Además, la relación C/N puede
variar en diferentes entornos y en diferentes momentos, lo que puede afectar el
crecimiento y la reproducción de los organismos. Por lo tanto, comprender la relación
C/N es esencial para comprender las interacciones en los ecosistemas y la producción
de alimentos27. La formación de glutamato a partir del oxoglutarato en el ciclo de los
ácidos tricarboxílicos conecta el metabolismo del nitrógeno y del carbono, permitiendo
la síntesis de moléculas orgánicas que contienen tanto nitrógeno como carbono. Sin
embargo se ha encontrado que en situaciones de bajos niveles de oxígeno, el excedente
de la fuente de carbono que no se utiliza puede ser almacenado como PHA en el interior
de la célula5,42.
4.2.2.5.1 Fuentes de carbono alternativas
La utilización de bacterias para producir PHA a partir de residuos vegetales industriales
es una solución prometedora para reducir los altos costos de la biotecnología. Los
subproductos agrícolas y forestales, así como los de la industria alimentaria y de
biocombustibles, se están utilizando como fuentes de carbono alternativas para la
síntesis de PHA. Este enfoque sostenible no solo reduce los costos de producción, sino
que también contribuye a disminuir la cantidad de residuos generados, lo que es un paso
importante hacia la producción de plásticos biodegradables y la mitigación de la
contaminación ambiental13.
Al comprender que bacterias pueden desarrollar diferentes vías metabólicas productoras
de PHA dependiendo la enzima que presentes, se puede establecer o postular una
variedad de residuos industriales como fuentes de carbono ya sean compuestos por
carbohidratos propios o ácidos grasos29, 44. Por ejemplo, aceite de canola, aceites usados
de palma, melaza de remolacha, subproductos de lácteos, caña de azúcar, residuos de
uva, glucosa12,oligosacáridos de melaza de soja4, mucílago de café34, lodos residuales43,
entre otros45,46,47,48,49, 50.
4.2.2.6 Extraccion del PHA
La extracción de PHA es uno de los pasos más importantes, sin embargo, también es
uno de los procesos que generan mayor costo al momento de producir PHA y la
estandarización de métodos son variables dependiendo tanto el microorganismo que
está en estudio y el tipo de PHA que se haya producido1.
Unos de los más usados son por medio de hidrocarburos clorados tales como cloruro de
metileno, cloroformo, triclorometano o dicloroetano, suele ser usado para la extracción
de PHA de cadena corta. Sin embargo, un inconveniente que hay es la viscosidad del
26
PHB ya que está por encima del 5% (p/v) lo que dificulta la eliminación de restos
celulares. En cuanto a los PHA de cadena media son solubles en un rango más amplio,
esta técnica es costosa, por tal razón no es de preferencia en las industrias.
Se ha indagado en otras opciones como lo son el etilen o propilen carbonato o métodos
donde por medio de la ruptura de las celular por hipoclorito de sodio ya que este puede
digerir componentes celular diferentes al polímero y con ayuda del cloroformo
solubiliza los gránulos liberados y de tal manera lo protege de la actividad degradativa.
El tiempo, la temperatura y concentración de estos compuestos deben ser
estandarizados según el microorganismo usado1.
Otra alternativa en la que se ha estudiado es uso de enzimas como lisozima, alcalasa y
fosfolipasas que combinadas con elementos que tiene actividad superficial pueden
degradar los componentes celulares distintos al polímero, sin embargo su desventaja en
la baja pureza que tendría el producto3
4.2.2.7 Biodegradación del PHA
Gracias a la composición monomérica de los PHA es altamente susceptible a la
biodegradación. Estos pueden ser degradados por una amplia gama de
microorganismos, hasta el punto de producir dióxido de carbono, agua o metano, en
diferentes condiciones tanto aerobias como anaerobias, sin la formación de sustancias
tóxicas. El tiempo de degradación es variable, las temperaturas mesofílicas son las
ideales para poder llevarse a cabo este proceso, debido a que aumenta la
biodisponibilidad y solubilidad de estos productos haciéndolos más sensibles al ataque
enzimático permitiendo una rápida degradación. Un método altamente estudiado es el
compostaje6.
4.2.2.8 Aplicaciones del PHA
El alto peso molecular de los PHA han logrado entrar a competir en el mercado de
plásticos donde está muy posicionados los plásticos sintéticos, no obstante, estos
polímeros al ser manejables como un polímero de origen petroquímico ha podido llegar
a abordar múltiples esferas de la industria. Es por ello que es candidato para la industria
de empaques, medicina, farmacia, agricultura, alimentos y como materia prima para la
producción de pinturas. Suelen ser usados como recipientes para envasar el shampoo,
productos alimenticios, productos de cuidado personal, productos desechables (pañales)
y cubiertos desechables. Uno de sus productos se suele usar como látex fibroso para
recubrir el papel o cartón. En la agricultura no requiere un alto grado de purificación y
por esta razón pueden facilitar su extracción. En la industria de alimentos si puede
reemplazar el PET, puede usarse recubierta para quesos26,48, 51 .
El descubrimiento de este biopolímero significa un gran hito y un avance a las industria
biomédica ya que son biocompatibles con los tejidos del ser humano. Un ejemplo de su
aplicación es la sustitución de hilos de sutura, sustitutos pericárdicos y sistemas de
liberación de medicamentos, ya que al momento de ser implantado este material en el
27
cuerpo se hidroliza en metabolitos compatibles. También son usados como material
osteosíntesis de fijación para estimular la formación del hueso6,8,51, 52.
28
5. Diseño metodológico
5. 1 Tipo de estudio
Revisión documental de tipo descriptivo y analítico. Se tuvieron en cuenta los artículos
de investigaciones y decretos publicados desde el año 1992 hasta el año 2023, las
palabras claves usadas para la búsqueda se realizó en español como en inglés:
Palabras claves usadas: Bacillus, polihidroxialcanoatos, biopolímeros, gen de la PHA
sintasa
Bases de datos consultadas: Nature, Oxford academic, Sage journals, Scopus, Taylor
and Francis Group y Google Scholar
5.2 Universo
7.097 artículos científicos o trabajos de grado en idioma inglés y español de la base de
datos Nature, Oxford academic, Sage journals, Scopus, Taylor and Francis Group y
Google Scholar relacionados con polihidroxialcanoatos (PHA) y género Bacillus
5.3 Población
500 artículos científicos o trabajos de grado relacionados con posibles alternativas
donde se limita a la producción de PHA a partir de microorganismos (Bacterias)
5.4 Muestra:
53 artículos científicos o trabajos de grado donde producen plásticos biodegradable de
origen microbiano en especial con microorganismos que pertenecen al género Bacillus,
que además hacen uso de fuentes de carbono alternativas y posibles mejoras tanto
genéticas como en el medio de cultivo (fisicoquímicas) para la síntesis del PHA.
5.5 Criterios de inclusión:
- Implementan el uso de microorganismos para producción de PHA.
- Producción de PHA de origen microbiano con fuentes de carbono alternativas .
- Mejoramiento de condiciones genéticas o fisicoquímicas a los microorganismos para
lograr mayor producción de bioplásticos.
- Aislamiento de microorganismos de diferentes ecosistemas.
5.6 Criterio de exclusión:
- Uso de plantas para producción de PHA
29
5.7 Herramienta estadística:
- Google sheets - Excel
La consulta de los artículos de investigación se realizó en las bases de datos
mencionadas, entre los años 2020 y 2023. (Tabla 1)
Tabla 1: Primera filtración
Bases de datos Promedio de número de artículosencontrados
Nature
Oxford academic
Sage journals
7.097
Scopus
Taylor and Francis Group
Google Scholar
Elaboración: Ramírez A, 2023
Para la segunda filtración se tuvo en cuenta los criterios de inclusión y exclusión,
obteniendo así el número de artículos encontrados de la base de datos aplicando los
filtros respectivos de esta para así cumplir con todos los criterios. (Tabla 2)
Tabla 2: Segunda filtración
Bases de datos Promedio de número de artículosencontrados
Nature
Oxford academic
Sage journals
500
Scopus
Taylor and Francis Group
Google Scholar
Elaboración: Ramírez A, 2023
30
Posteriormente, en la última filtración se ejecutó la revisión y lectura detallada y
minuciosa de los resultados obtenidos mediante la base de datos. Se pudo notar que la
base de datos no era lo suficientemente específica para los criterios fijados, ya que se
incluían artículos sobre plasticos de origen sintético que se han podido degradar,
bacterias, plantas o bacterias que no son tan comunes para la implementación de esta
práctica o identificación de plástico producido sin detallar el proceso de obtención del
PHA.
Por último, para obedecer con los criterios acordados, la revisión se ejecutó con 50
artículos que fueron elegidos, teniendo en cuenta su importancia, trascendencia y aporte
que pudieron conferir a la revisión.
31
6. Resultados
Se llevaron a cabo revisiones y análisis de 50 documentos, con información que data
desde 1992 hasta 2023, para obtener una amplia comprensión de los plásticos de origen
petroquímico, los polihidroxialcanoatos y sus derivados, los microorganismos
productores de biopolímeros del género Bacillus spp., las diferentes alternativas de
fuentes de carbono, así como las técnicas de extracción y los diversos usos de estos
productos. En la tabla 3 se organizó la bibliografía recopilando el título, tema, autor,
idioma, año y país para así poder ofrecer información más estructurada y accesible al
lector.
En la Figura 10 se observa que el 23 % de los artículos analizados corresponden a la
producción de PHA por medio de microorganismos diferentes al género Bacillus y
también el 23 % de los documentos corresponden a la producción de bioplásticos
haciendo el uso de fuentes de carbono alternativas, lo que indica que la unión de
microorganismos capaces de sintetizar PHA y fuentes de carbono alternativas están
altamente relacionadas para poder desarrollar esta tecnología. El 19% de los artículos
revisados presentan diferentes condiciones fisicoquímicas en las que se puede
desarrollar Bacillus spp para lograr producir este producto natural, los artículos
relacionados con la producción de PHA con microorganismos pertenecientes al género
Bacillus es de 9%, el mismo porcentaje que las referencias bibliográficas que dan
contexto sobre los plásticos de origen petroquímico. La suma de los artículos que tienen
relación con las características, historia, condiciones, biodegradabilidad incluso
aplicación de PHA corresponde al 11%; el porcentaje más bajo está asignado al marco
legal con el 4% ya que son muy pocas las participaciones de los entes de control en la
industria productora de plástico.
Figura 10: Clasificación de los artículos según el eje de estudio
Elaboración: Ramirez A. 2023
32
Tabla 3. Ejes principales del documento de acuerdo al título, tema, autor año, país e idioma.
TÍTULO TEMA AUTOR AÑO PAÍS IDIOMA
Production of polyhydroxyalkanoates by Fuentes de carbono
Azotobacter vinelandii UWD in beet alternativas a base de Edmonton A. 1992 Canadá Inglés
molasses culture residuos industriales.
The influence of nutritional and
environmental conditions on the Condiciones fisicoquímicas Borah B, Thakur P, Estados
2002 Inglés
accumulation of poly-beta-hydroxybutyrate para cultivo de Bacillus spp. Nigam J. Unidos
in Bacillus mycoides RLJ B-017
Polihidroxialcanoatos y sus Almeida A, Ruiz J,
Bioplásticos: una alternativa ecológica. 2004 Argentina Español
características. Lopez N, Pettinari M.
Plásticos de origen
Fundamentos de polímeros López F. 2005 Venezuela Español
petroquímico.
Cloning and expression of the PHA synthase
genes phaC1 phaC1AB Bacillus Producción de PHA por Wang Y, Ruan L, Chuaand into 2006 China Inglés
subtilis medio de Bacillus spp. H, Hoi-Fu P.
33
Production of poly-beta-hydroxyalkanoates Fuentes de carbono
Full T, Jung D, Estados
from soy molasses oligosaccharides by new, alternativas a base de 2006 Inglés
rapidly growing Bacillus species Madigan M Unidosresiduos industriales.
Recuperación de poli-b-hidroxihexanoatoco-
Producción de PHA por Moreno N, Malagón
octanoato sintetizado por Pseudomonas
putida medio de otros D, Cortázar J, 2006 Colombia Españolmediante el uso de dispersiones
microorganismos. Espinosa A.
hipoclorito-cloroformo
Cofactor FeMco (M = Mo, V, Fe) en la Condiciones fisicoquímicas Ruiz B, Campos J,
2008 México Español
nitrogenasa para cultivo de Bacillus spp. Barba N.
Polyhydroxyalkanoate biosynthesis in
Bacillus cereus SPV under varied limiting Condiciones fisicoquímicas Valappil S, Rai R,
2008 Reino Unido Inglés
conditions and an insight into the para cultivo de Bacillus spp. Bucke C, Roy I.
biosynthetic genes involved
Producción de poli-hidroxialcanoatos por
Producción de PHA por
bacterias del género Bacillus de origen
medio de Bacillus Gonzalez M. 2008 México Españolspp.
marino
34
Evaluación del efecto de la relación carbono
nitrógeno y el nivel de oxígeno disuelto sobre Condiciones fisicoquímicas
la producción de biosurfactantes a partir de para cultivo de Bacillus Farfán M. 2008 México Españolspp.
Bacillus subtilis
plásticos de origen Estados
Applications and societal benefits of plastics Andrady A, Neal A 2009 Inglés
petroquímico. Unidos
Detección de gránulos de Producción de PHA por
polihidroxialcanoatos en la cepa USBA 355 medio de otros Blanco K. 2010 Colombia Español
Tistlia consotensis microorganismos.
Producción de poliésteres biopoliméricos Producción de PHA por
(pha) desde alpeorujo por medio de bacterias medio de otros Gonzalez J, Pozo C 2011 España Español
fijadoras de nitrógeno microorganismos.
Fuentes de carbono
Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) Lopez C, Alba J,
alternativas a base de 2011 México Inglés
with canola oil as carbon source Gracida J, Perez F.
residuos industriales.
FTIR analysis of polyhydroxyalkanoates by
novel Bacillus Condiciones fisicoquímicassp. AS 3-2 from soil of Kadi Shah K. 2012 Reino Unido Inglés
para cultivo de Bacillus spp.
region, North Gujarat, India
35
Síntesis y biodegradación de Producción de PHA por Gonzalez Y, Meza J,
polihidroxialcanoatos: plásticos de origen medio de otros Gonzalez O, Cordova 2013 México Español
microbiano microorganismos. J.
Aplicación de Valero E, Ortegón Y,
Biopolímeros: avances y perspectivas 2013 Colombia Español
polihidroxialcanoatos Uscategui Y.
Bioprospección de bacterias productoras de Producción de PHA por
polihidroxialcanoatos (pha's) en el medio de otros Otero I, Fernandez P. 2013 Colombia Español
departamento de Nariño microorganismos.
Dinámica de los gránulos de Producción de PHA por
polihidroxibutirato durante el ciclo celular de medio de otros Salinas A. 2013 México Español
Caulobacter crescentus. microorganismos.
Identificación de bacterias productoras de
Condiciones fisicoquímicas Sánchez S,Marín
Polihidroxialcanoatos (PHAs) en suelos ColombiaBacillus 2013 Españolpara cultivo de spp. M,Mora A,Yepes M
contaminados con desechos de fique
Obtención de poli-3-hidroxibutirato (p3hb) a
Producción de PHA por
partir de la extracción de pectina del
medio de otros Gonzalez M. 2014 Colombia Español
mucílago de café con Streptomyces sp.
microorganismos.
Aislados de suelos de Boyacá (Colombia).
36
Optimization and characterization of Condiciones fisicoquímicas
Bacillus cereus Bacillus Pradhan S. 2014 India Inglésbioplastic produced by SE1 para cultivo de spp.
Giin-Yu T, Chia C,
Start a Research on Biopolymer Polihidroxialcanoatos y sus
Ling L, Liya G, Lin 2014 Singapur Inglés
Polyhydroxyalkanoate (PHA): A Review características.
W.
Polihidroxialcanoatos (PHA) producidos por
Aplicación de
bacterias y su posible aplicación a nivel Lemos A, Mina A 2015 Colombia Español
polihidroxialcanoatos
industrial
Production, optimization and characterization
Producción de PHA por Bhagowati P, Pradhan Estados
of polyhydroxybutyrate, a biodegradable 2015 Inglés
plastic by Bacillus medio de Bacillus spp. S,Dash H,Das S Unidosspp.
Bacterial
polyhydroxyalkanoates-eco-friendly next
Polihidroxialcanoatos y sus Muhammadi, Shabina,
generation plastic: Production, 2015 Pakistan Inglés
características. Muhammad, Hameedd
biocompatibility, biodegradation, physical
properties and applications
Aislamiento de hongos con potencial para Fuentes de carbono
sintetizar polihidroxialcanoatos (PHAs) a alternativas a base de Pintor S 2016 Colombia Español
partir de grasas y aceites en aguas residuales residuos industriales.
37
Bioplásticos: obtención y aplicaciones de Aplicación de
Álvarez L 2016 españa Español
polihidroxialcanoatos polihidroxialcanoatos
Extracción y caracterización estructural de un
pha, obtenido de residuos de cáscaras de yuca Fuentes de carbono
y piña mediante procesos de fermentación; y alternativas a base de Vega O 2016 Colombia Español
su aplicación en la fabricación de fibras por residuos industriales.
electrospinning.
Producción de PHA por
Bacterias productoras de polímeros para su
medio de otros Ibáñez M 2017 España Español
utilización como plásticos biodegradables
microorganismos.
Contaminación ambiental y bacterias Plásticos de origen Segura D, Noguez R
2017 México Español
productoras de plásticos biodegradables petroquímico. Espín G
GacA regulates the PTSNtr-dependent Producción de PHA por
Azotobacter Trejo A,Moreno Estadoscontrol of cyst formation in medio de otros 2017 Inglés
vinelandii S,Cocotl M, Espin G Unidosmicroorganismos.
Contaminación por residuos: Islas de Plásticos de origen
Socas M. 2018 España Español
plásticos petroquímico.
38
Producción de phb en Azotobacter vinelandii
Fuentes de carbono
op, utilizando orujo de uva como fuente de
alternativas a base de Nuñez Y 2019 Chile Español
carbono a distintas razones
residuos industriales.
carbono/nitrógeno
An investigation for recovery of
polyhydroxyalkanoates (PHA) from Bacillus Producción de PHA por Mohamed S, Estados
Bacillus 2019 Ingléssp. BPPI-14 and sp. BPPI-19 medio de Bacillus spp. Lopamudra R Unidos
isolated from plastic waste landfill
Identificación Molecular de Bacterias Fuentes de carbono
Cardona A,Mora
Productoras de Polihidroxialcanoatos en alternativas a base de 2019 Colombia Español
A,Marín M
Subproductos de Lácteos y Caña de Azúcar residuos industriales.
Bioprospección de bacterias obtenidas de
Condiciones fisicoquímicas
suelo y su aplicación potencial en la Bacillus Araya V 2019 Colombia Ingléspara cultivo de spp.
producción de polihidroxialcanoatos (PHAs)
Effects of chemical oxygen demand
concentration, pH and operation cycle on Condiciones fisicoquímicas Estados
Liu Y, She Z, Gao M 2019 Inglés
polyhydroxyalkanoates synthesis with waste para cultivo de Bacillus spp. Unidos
sludge
39
Estimación de parámetros cinéticos de un
Fuentes de carbono
cultivo mixto microbiano basado en bacterias
alternativas a base de Pedraza A,Poveda D 2020 Colombia Inglés
acumuladoras de pha, procedentes de un
residuos industriales.
sistema de lodos activados
Andlera R, Pinoa V,
Synthesis of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) Fuentes de carbono
Bacillus cereus Moyaa F, Sotoa E,by using grape residues as alternativas a base de 2021 Chile Inglés
Valdésb C, Andreeße
sole carbon source residuos industriales.
C
Obtención de polihidroxibutirato (phb) a
Fuentes de carbono
partir del subproducto glicerol procedente de
alternativas a base de Astudillo M.Olmedo L 2021 Ecuador Español
la transformación de aceites usados de palma
residuos industriales.
a biodiesel"
Production and characterization of poly
Fuentes de carbono
3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate in Neda S, Davood Z,
alternativas a base de 2021 Brasil Inglés
wheat starch wastewater and its potential for Mehrdad A,
residuos industriales.
nanoparticle synthesis
40
Systems Based on Biobased Thermoplastics:
Aplicación de Morinval A, Averous
From Bioresources to Biodegradable 2021 EE.UU Inglés
polihidroxialcanoatos L
Packaging Applications
Villota G, Gonzales
K,Marulanda
Aislamiento y caracterización de bacterias Producción de PHA por M,Fernando
productoras de biopolímeros a partir de medio de otros N,Steffanny 2022 Colombia Español
efluentes industriales microorganismos. V,Ocampo L,
Castañeda L, Giraldo
C, Rodriguez N
Selección de bacterias productoras de
Condiciones fisicoquímicas
polihidroxialcanoatos a partir de un prototipo Bacillus Aragon F, Martinez C 2022 Colombia Españolpara cultivo de spp.
para la automatización del ciclo feast-famine
La evolución regulatoria de plásticos de un
Marco legal Orjuela K 2022 Colombia Español
solo uso en Colombia
Ley 2232 de 2022 Marco legal 2022 Colombia Español
41
Producción de PHA por
Producción de PHA por bacterias aisladas del
medio de otros Lopez O 2022 México Español
estado de Nuevo León, México.
microorganismos.
Producción de plásticos biodegradables a Fuentes de carbono
partir de bacterias de hábitats salinos aisladas alternativas a base de Álvarez G 2022 Guatemala Español
de la Laguna de Ayarza residuos industriales.
Study of the Fermentation Conditions of the
Bacillus cereus Producción de PHA porStrain ARY73 to Produce Bacillus Yasin A, Mayaly I. 2021 Iraq Inglésmedio de spp.
Polyhydroxyalkanoate (PHA) from Glucose
Microbial polyhydroxyalkanoates (phas): a Producción de PHA por
Addagada L, Pathak P,
brief overview of their features, synthesis, medio de otros 2022 India Inglés
Kashif M, Ranjan R
and agro-industrial applications microorganismos.
Fossil fuel is the common denominator
Trowbridge J, Goin D,
between climate change and petrochemical Plásticos de origen Estados
Abrahamsson D, Sklar 2023 Inglés
exposures, and effects on women and petroquímico. Unidos
R, Woodruff T.
children's health
Elaboración: Ramírez A, 2023
42
Figura 11: Frecuencia relativa de documentos según el país de publicación
Elaboración: Ramirez A. 2023
En la figura 11, se observa la frecuencia relativa de documentos según el país de publicación.
Donde el país del cual se pudo obtener más información es Colombia, con un aporte del 30%
de diferentes documentos. Es de gran importancia notar esto ya que nos expone que el tema
de producción de plásticos biodegradables a partir de microorganismo ha sido un tema de
investigación. Esto demuestra que las diferentes industrias productoras de plástico, al aliarse
con la ciencia, podrían generar nuevas oportunidades de mercado para estos productos y así
generar la transición de plásticos sintéticos a soluciones sostenibles, tal como lo propone la
ley 3222 del 2022. Cabe resaltar, que esta problemática y solución se está abordando a nivel
global ya que se obtuvo información de los diferentes continentes.
6.1 Condiciones fisicoquímicas
- Efectos según la concentración de fuente de carbono
Se analizó el comportamiento de la bacteria con diferentes concentración de glucosa, para
poder comprender el comportamiento de esta y su relación con la producción de PHA. Donde
se evidencio según Yasin Et al , que los cultivo que tenían concentraciones del 2 % de
glucosa obtuvieron un recuento celular de 2,2x 10^9 células/ml y el rendimiento de PHA de
fue 1,78 g/L lo que representa el 49% del peso de la biomasa celular6. Transversalmente se
observó que los medios que estaban preparados con una concentración del 8% de glucosa, se
observó a las 48 horas, 2.4 x 10 ^9 células/ml pero sin producción de PHA. La disminución
de producción de plástico se evidencio a medida que se incrementa la producción de
glucosa20 .Es por ello que se puede dar una explicación de que las concentraciones más altas
de azúcar pueden inhibir el cultivo, disminuir sus tasas metabólicas y afectar la capacidad del
aislado para producir PHA. (Figura 12A)
- Efectos según el pH inicial.
43
En el estudio realizado, se investigó la respuesta del aislado B. cereus a diferentes niveles de
pH. El cultivo se llevó a cabo a pH 5, 7 y 9, utilizando la temperatura óptima de 35°C durante
un período de 96 horas.
Los resultados mostraron que la cepa B. cereus alcanzó su máxima producción de PHA en pH
7, en los días 48 y 96 horas, obteniéndose 2,65 g y 2,74 g respectivamente. Sin embargo, al
aumentar el pH a 9, se observó una disminución en la producción de PHA, obteniéndose 0,48
g y 0,44 g en 48 horas y 96 horas respectivamente.
Por otro lado, se observó que al disminuir el pH a 5, la cepa B. cereus no produjo PHA. Esto
sugiere que esta cepa prefiere un pH neutro para su crecimiento y producción de PHA,
aunque también es capaz de producirlo en menor cantidad en un medio alcalino (pH 9), en
contraste con un medio ácido. (Figura 12 C)
Figura 12: Variación en condiciones físico-químicas, valores de producción de PHA A) Concentración de
glucosa optimizada, rendimiento de PHA por 48 y 96 h, B) Diferentes temperaturas 25, 30, 35 y 40 °C, glucosa
2 % (p/v). C) pH 5, 7 y 9 a temperatura favorita 35 °C y glucosa 2% (p/v) D) Concentraciones de nitrógeno
preferidas (0,75 y 1,0%) para la producción de PHA por B. cereus
Fuente: Yasin. A. 2021
44
- Efectos según el temperatura
Se observó que la producción de PHA fue notable en un rango de temperatura de 30 a 35 °C.
Se destaca que la temperatura óptima para obtener la máxima producción de PHA fue de 35
°C, alcanzando un contenido de 2,61 g/L con un impresionante porcentaje de PHA del 76%
después de 96 horas de incubación. Además, se observó que se consumió aproximadamente
el 1,36% de la glucosa en este ensayo.
Sin embargo, cuando la temperatura se elevó a 40 °C, no se detectó ninguna producción de
PHA. A pesar de esto, la cepa aún pudo crecer con un peso seco celular de 3,41 g/L y 2,51
g/L a las 48 y 96 horas, respectivamente. Estos resultados sugieren que tener un mayor peso
celular no necesariamente se traduce en un aumento en la producción de PHA.(Figura 12 B)
- Efectos según la concentración de carbono/nitrógeno:
Es de suma importancia las concentraciones de nitrógeno en el medio ya que son las
responsables de crear un equilibrio con el carbono y poder lograr una producción óptima de
biopolímeros y garantizar un crecimiento celular. Se observó que se obtuvo una mayor
producción de PHA cuando se utilizaron concentraciones de nitrógeno del 0,75% y 1% (p/v).
En particular, se alcanzaron concentraciones de PHA de 2,87 g/L (con un porcentaje de PHA
del 77%) y 2,34 g/L (con un porcentaje de PHA del 79%) respectivamente. Por otro lado, una
baja concentración de nitrógeno del 0,5% (p/v) disminuyó la producción de PHA y limitó la
cantidad de PHA acumulado en la biomasa. Estos resultados indican que concentraciones de
nitrógeno por encima de la media (0,5-1% p/v) redujeron la producción de PHA. (Figura 12
D)
6.2 Rutas metabólicas y enzimas empleadas en por Bacillus spp.
Para sintetizar polihidroxialcanoatos (PHA), Bacillus utiliza la ruta de degradación de
carbohidratos. Esta ruta metabólica descompone los carbohidratos y produce acetil-CoA
como resultado final. La cetotiolasa, la acetoacetil-CoA reductasa y la PHA sintasa son
algunas de las enzimas que participan en el proceso de síntesis de PHA. La conversión de
acetoacil-CoA en acetil-CoA es catalizada por la cetotiolasa; la reductasa de acetoacetil-CoA
reduce el acetoacil-CoA a (R)-hidroxialcanoil-CoA; y finalmente, la sintasa de PHA
polimeriza los monómeros de (R)-hidroxialcanoil-CoA, lo que da como resultado la
formación de PHA. (Figura 13)
45
Figura 13: Ruta metabólica para la síntesis y degradación intracelular de PHB a partir de carbohidratos. Se indican
las principales enzimas implicadas en el proceso
Fuente: Lemos AC, Mina A. 2015
La ruta de degradación de carbohidratos depende principalmente de las enzimas phaA, phaB
y phaC. Estas enzimas catalizan reacciones importantes que llevan a la síntesis de PHA.
La enzima cetotiolasa participa en la primera etapa de la ruta I. Cataliza la rotura de la
acetil-CoA en dos moléculas de acetato, que luego se pueden usar como sustrato para la
síntesis de PHA. Otra enzima crucial en esta ruta es la acetoacetil-CoA reductasa. Convertir
el acetoacetil-CoA en (R)-hidroxialcanoil-CoA es su trabajo. Este es el monómero precursor
esencial para la síntesis de PHA. Dado que determina la disponibilidad de
(R)-hidroxialcanoil-CoA, esta enzima actúa como un paso limitante en la producción de
PHA. Las demás enzimas son usadas en las diversas rutas metabólicas y cumplen una función
en la síntesis de PHA, en la siguiente tabla explica las diferentes funciones y características
de las enzimas necesarias. (Tabla 4)
Tabla 4: Enzimas utilizadas en el proceso de producción de PHA, su funcion y rutas en las que trabaja
Enzima Función Ruta Metabólica
phaA Cliva β-cetoacil-CoA en dos Ruta I
moléculas de acetil-CoA
(β-cetotiolasa)
phaB Reduce acetoacetil-CoA a Ruta I
(acetoacetil-CoA (R)-3-hidroxibutiril-CoA Ruta II
reductasa)
46
phaC Polimeriza los monómeros de Ruta I
(R)-hidroxialcanoil-CoA en un Ruta II
(PHA sintasa)
biopolímero de PHA Ruta III
phaG Transporta 3-hidroxialcanoil-CoA Ruta II
(proteína transportadora de desde la β-oxidación al sitio de
3-hidroxiacil-acil síntesis de PHA
Coenzima A transferasa)
phaJ Hidrata los enoil-CoA a Ruta II
(enoil-CoA hidratasa) 3-hidroxialcanoil-CoA
Elaboración: Ramírez A, 2023
6.3 Fuentes de carbono alternativas.
Dentro de los ejes de estudio, se encuentra de manera predominante la producción de PHA de
otros microorganismos y fuentes de carbono alternativas a base de residuos industriales, lo
cual expone gran cantidad de posibilidades para poder desarrollar modelos que permitan
sintetizar PHA de manera sostenible llevando a cabo programas de biorremediación,
reducción de huella de carbono y mitigar la producción de residuos por parte de las industrias
agrícolas y alimentarias, dándole una segunda oportunidad.
En la tabla 5 se clasifica según las cepas más usadas, medios de cultivos modificados, la el
contenido de PHA y la productividad de (g/kg/h); los dos últimos parámetros son de alta
importancia ya que a partir de ellos se pueden tomar decisiones en cuanto a ser usado por la
industria. Se debe tener en cuenta que los microorganismos usados a lo largo de los artículos
analizados suelen ser del mismo género y especie sin embargo presentan modificaciones
genéticas. Pseudomonas fluorescens obtuvo mayor concentración de PHA es la con un
porcentaje del este biopolímero en la célula con el 70 %, con un 0.304 g/kg/h . La velocidad
de crecimiento de Bacillus spp, desarrolla su fase exponencial entre las 4 a 27 horas de
incubación, ya el tiempo después, se registra como fase estacionaria53
Tabla 5: Resumen de estudios que informan la producción de PHA por cultivo batch.
Elaboración:Nuñez AN.
47
6.4 Extracción y tratamiento de PHA
Unos de los más usados son por medio de hidrocarburos clorados tales como cloruro de
metileno, cloroformo, triclorometano o dicloroetano, suele ser usado para la extracción de
PHA de cadena corta. Sin embargo, un inconveniente que hay es la viscosidad del PHB ya
que está por encima del 5% (p/v) lo que dificulta la eliminación de restos celulares. En cuanto
a los PHA de cadena media son solubles en un rango más amplio, esta técnica es costosa, por
tal razón no es de preferencia en las industrias.
Se ha indagado en otras opciones como lo son el etilen o propilen carbonato o métodos donde
por medio de la ruptura de las celular por hipoclorito de sodio ya que este puede digerir
componentes celular diferentes al polímero y con ayuda del cloroformo solubiliza los
gránulos liberados y de tal manera lo protege de la actividad degradativa. El tiempo, la
temperatura y concentración de estos compuestos deben ser estandarizados según el
microorganismo usado1.
Otra alternativa en la que se ha estudiado es uso de enzimas como lisozima, alcalasa y
fosfolipasas que combinadas con elementos que tiene actividad superficial pueden degradar
los componentes celulares distintos al polímero, sin embargo su desventaja en la baja pureza
que tendría el producto3
En la Figura 12 se especifica el proceso de producción de biopolímeros, se registra en la
literatura diferentes métodos de extracción de plástico, tales como solventes enzimáticos,
reacciones químicas, uso de enzimas que lisan la membrana celular, sin embargo el más
usado es extracción química con cloroformo e hipoclorito, ya que se ha demostrado que
aumenta el valor de la pureza con un 95 % comparado con los demás metodos3. En cuanto al
procesamiento del plástico del polímero, se puede manejar como plásticos de origen
petroquímico y destinar su uso en la industria biomédica o fabricación de material de uso
común.
Figura 14: Esquema general de producción de PHA, en el que se indican las características de los procesos de
fermentación, recuperación y procesamiento del polímero según su uso final
Elaboración: Ramirez A
6.5 Limitaciones y beneficios de la producción de PHA
La producción de polihidroxialcanoatos (PHA) como una alternativa sostenible a los plásticos
convencionales ha despertado un gran interés. Sin embargo, hay varias limitaciones en su
48
comercialización que han obstaculizado su adopción a gran escala12. El alto costo de
producción, la inestabilidad de las propiedades termomecánicas y la escasez de suministros
de monómeros son algunas de estas limitaciones. Se han realizado grandes esfuerzos para
abordar estos problemas y encontrar soluciones para superar estas limitaciones, así como para
promover la producción y aplicación exitosa de PHA24.(Tabla 6)
Tabla 6: Limitaciones y soluciones al producir PHA por medio de Bacillus spp.
Limitaciones Soluciones
Alto costo de producción debido a la - Uso de bacterias extremófilas
demanda de energía, esterilización combinadas con ingeniería metabólica y
complicada, aireación intensiva y costoso biología sintética para abordar los
procesamiento posterior1 desafíos de producción35
Baja conversión de sustratos de carbono - Desarrollo de enfoques de ingeniería
en productos PHA17 para aumentar la conversión de sustratos
de carbono en PHA3
Propiedades termomecánicas inestables - Investigación en la actividad de la PHA
debido a pesos moleculares y estructuras sintasa y suministro de monómeros para
inestables29 mejorar la estabilidad de las propiedades
termomecánicas45
Los polihidroxialcanoatos (PHA) tienen muchas ventajas. Estos biopolímeros son una
alternativa sostenible al plástico tradicional ya que son biodegradables y compostables16.
Además, tienen una amplia gama de usos potenciales, que van desde la industria de empaque
hasta la medicina regenerativa. La producción de PHA reduce la acumulación de desechos y
la dependencia de combustibles fósiles. Estos beneficios hacen que PHA sea una opción
atractiva para aquellos que buscan soluciones más amigables con el medio ambiente. Además
que potencia la ingeniería metabólica y biología sintética, ya que brinda nuevos campos de
investigación, que con proyectos de investigación multidisciplinarios se pueden lograra
avances desde el aprovechamiento de residuos industriales o agrícolas, como el la
optimización de microorganismos para la producción de plásticos por medio de modificación
genética y mejoramiento en procesos de extracción y procesamiento del plástico con el fin de
reducir costos30 .
49
7. Discusión
Existen diferentes características que hacen que este Bacillus spp, presenta ventajas con
respecto al resto de los microorganismos52, como lo es su estabilidad genética, mayor tasa de
crecimiento en comparación a las demás, ausencia de lipopolisacáridos en su capa externa lo
cual facilita la extracción de la síntesis de PHA, tiene la capacidad de producir este
biopolímero usando fuentes de carbono de bajo costo y segregan una cantidad de enzimas
hidrolíticas que pueden ser usadas la industrias en diferentes procesos que permiten
compensar costos de producción de PHAs4.
Este microorganismo tiene la capacidad de producir esporas en condiciones de estrés y
paralelamente también sintetiza PHA, esto representa un riesgo ya que se producen al mismo
tiempo, y la presencia de estas esporas puede ocasionar peligro en la salud del consumidor.
Asimismo, la bacteria debe repartir la energía obtenida para poder producir esporas y síntesis
de PHA; sin embargo, se ha demostrado que el desarrollo de condiciones de cultivo con pH
ácido y deficiencia de potasio con el fin de inhibir el crecimiento y formación de esporas y
así mejorar la síntesis del polímero16.
Dentro de los biopolímeros sintetizados por Bacillus se encuentran homo y copolímeros tales
como ácido polihidroxibutírico, Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) o
poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato), estas variaciones se dan dependiendo la
especie de este género que lo sintetice, también de su metabolismo, fuente de carbohidrato
fermentable, curvas de crecimiento que pueden variar y la presencia de la enzima PHA
sintasa. Durante la revisión bibliográfica la se han registraron un grupo de genes pha donde
se encuentras siete genes como phaRYB4, phaBYB4, phaCYB4, phaQYB4, phaPYB4,
ORF1 y phaJYB4 11, los cuales codifican proteínas implicadas en la síntesis del polímero y
así mismo responsable de la variación en la cantidad de acumulación. Por consiguiente las
condiciones y concentraciones de los nutrientes tienen relevancia en las diferentes fases de
crecimiento de las bacterias. Por ende en la fase exponencial, las células usan la ruta
Entner-Doudoroff (EDP) ya que la ruta oxidativa de las pentosas fosfato no está activa. En su
lugar, las reacciones que generan Ribosa-5-fosfato (R5P) ocurren en sentido inverso a la ruta
pentosa fosfato (PP)36. El flujo de Acetil-CoA se divide en tres partes: la producción de
polímeros, la síntesis de citrato en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) y las rutas
anabólicas que construyen aminoácidos y lípidos. La mayor parte del Acetil-CoA se usa para
producir PHAs, lo que reduce el flujo hacia el ciclo CAT y las rutas anabólicas que lo
consumen20.
Las condiciones fisicoquímicas brindadas al microorganismo tienen un papel importante para
su buena producción. La concentración de hidrogeniones (pH), es de gran relevancia, por ello
en diversa literatura se ha ajustado el pH de los medios de cultivo a 7.0, para poder tener una
acumulación de PHA óptima33. Sin embargo, por la bioquímica del metabolismo de las
bacterias puede presentar variaciones a medida que van ocurriendo cada una de las fases del
microorganismo, como lo es la disminución de este cuando el microorganismo se encuentra
en la fase de crecimiento atribuido al consumo de iones de amonio que son producto del
rompimiento de los triglicéridos por acción de la lipasa. Si bien B. cereus es un
50
microorganismo aerobio, los niveles de oxígeno es uno de los requerimientos que deben ser
controlados, ya que los niveles de PHAs son bajos, puede ser debido a una mayor
oxigenación que dirige el metabolismo hacia una tasa de respiración más alta. Esto conduce a
una mayor oxidación del sustrato, lo que reduce la disponibilidad de Acetil-CoA, que es
necesario para producir PHAs. Por lo tanto, cuando hay bajos niveles de oxigenación y una
fuente de carbono en exceso, el metabolismo genera altas concentraciones de NADH+ y
Acetil-CoA. Estos compuestos deben ser convertidos en formas que no afecten el equilibrio
redox de la célula, lo que lleva a la producción de PHAs37.
Las fuentes de carbono tienen una relevancia significativa tanto en el crecimiento de la
biomasa como en la síntesis de PHA, hay una tendencia en los microorganismo para preferir
una fuente de carbono en particular, pero se ha demostrado que la cepa bacteriana puede
producir diferentes cantidades de PHAs según la fuente de carbono que utilice. Wautersia
eutropha utilizó 75 g L−1 de aceite de canola como fuente de carbono,
de los cuales se consumió el 15%, el rendimiento obtenido fue de
0,68 gcPHA gc−1, la biomasa seca resultante contenía un 92% de PHA.
Con melaza de soja8 Bacillus sp evidencia mayor afinidad por la rafinosa, con una
productividad de 3,00 mg ml^-1 y un contenido de PHA de 89,7%.La glucosa y la sacarosa
también produjeron altos contenidos de PHA de 90,9 % y 87,0 %, respectivamente, mientras
que la fructosa y la lactosa produjeron contenidos de PHA ligeramente más bajos de 86,3 % y
81,7 %, respectivamente.
Dentro de la bibliografía consultada podemos separar en dos grupos las fuentes de carbono,
una son aquellas que tiene presencia de altas concentraciones de carbohidratos como los son
las melazas residuales de industrias agrícolas y la segunda son aquellos desechos también de
la industria alimentaria como los residuos de la palma de cera (glicerol)8. Dependiendo la
maquinaria enzimática y las vías metabólicas que pueda realizar el microorganismos podrá
hacer fermentación de estas opciones, ya que pueden tomar la ruta de la β-oxidación de
Ácidos grasos o el ciclo del ácido cítrico, en comparación con las demás fuentes de carbono,
el glicerol produjo el contenido más bajo de PHA de 52,1% 37. Por otro lado, la sacarosa se ha
demostrado que es una fuente de carbono favorable para la acumulación de PHA, ya que
produce un 5% de acetil Co-A34, lo que aumenta la producción de PHAs. Además, la
estructura de la molécula de sacarosa, compuesta por glucosa y fructosa, puede influir en la
degradación de las mismas por parte de las bacterias. De hecho, en un estudio se encontró que
44 de 108 aislamientos bacterianos producían PHAs cuando se utilizó sacarosa como fuente
de carbono. El glicerol residual es una fuente de carbono económica para el proceso de
producción de PHA, pero la rafinosa, glucosa y sacarosa parecen ser las fuentes de carbono
más favorables para la producción de PHA.
51
8. Conclusiones
- La producción de plásticos biodegradables es un tema de importancia tanto científica
como industrial por ello ha sido a su vez mayor su estudio y divulgación. Sin embargo
no ha sido suficiente para contrarrestar los efectos del uso indiscriminado del plástico.
Si bien se evidencio que es un tema que es estudiado alrededor del mundo. Se
requiere la generación de alianzas entre entes académicos, industriales y políticos
para promover esta solución, de tal manera se evite el uso de plásticos de origen
petroquímico.
- Bacillus spp. es un microorganismo con gran potencial para la producción de plásticos
biodegradables debido a su capacidad para producir polihidroxialcanoatos (PHAs)
utilizando diferentes fuentes de carbono. Presentando ventajas frente a otros
microorganismos, como una mayor tasa de crecimiento, estabilidad genética y la
ausencia de lipopolisacáridos en su capa externa, lo que facilita la síntesis y
extracción de PHA. Hace uso de las enzimas (phaA, phaB, phaC , phaG, phaJ),
indispensables para poder llevar a cabo la la ruta metabólica de su preferencia.
- La síntesis de PHA por Bacillus spp. puede verse afectada por la producción
simultánea de esporas, que pueden ser peligrosas para la salud humana. Sin embargo,
el uso de condiciones de cultivo específicas puede inhibir la formación de esporas y
mejorar la síntesis de PHA
- El género de bacterias estudiado puede producir diferentes tipos de PHA según la
especie, el metabolismo y la fuente de carbohidratos fermentables. La síntesis de estos
polímeros involucra la enzima PHA sintasa y un grupo de genes llamados pha.
- El uso de fuentes alternativas de carbohidratos, como los desechos agrícolas y de la
industria alimentaria, puede ser usados como reemplazo de elementos sintéticos, se
observó que esta bacteria tuvo mayor producción de PHA cuando su fermentación uso
maltosa como fuente de carbono. El uso de esta alternativa genera una solución a la
producción de residuos y desecha la huella de carbono y a su vez el desarrollo de
métodos eficaces y oportunos permite reducir los costos de producción de los PHA.
52
9. Referencias bibliográficas
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