El presente trabajo se centró en la detección molecular de los virus de leucemia felina (FeLV) y de inmunodeficiencia felina (FIV) mediante la aplicación de la técnica de PCR a partir de muestras de hisopado oral obtenidas de gatos. Para ello, se llevó a cabo la estandarización de primers específicos y la caracterización de los rangos dinámicos de detección mediante ensayos de PCR uniplex y multiplex en tiempo real, logrando identificar cargas virales bajas con alta sensibilidad y especificidad. Las muestras de hisopados orales fueron sometidas a un proceso manual de extracción de ARN mediante el método salting out, el cual permitió obtener material genético de calidad suficiente para la amplificación, aunque se evidenciaron leves impurezas en algunos extractos. La amplificación del gen endógeno VEGFA, empleado como control interno, confirmó la integridad del ARN y la ausencia de inhibidores en las reacciones, garantizando la fiabilidad de los resultados. De las muestras analizadas, se detectó un caso positivo para FeLV y ninguno para FIV. Se observó cierta variabilidad en los resultados atribuible a diferencias en la técnica de muestreo, ya que la toma de muestras fue realizada por distintos voluntarios. Este hallazgo coincide con investigaciones previas que destacan la necesidad de estandarizar los procedimientos de recolección para optimizar la reproducibilidad diagnóstica. En síntesis, el sistema RT-qPCR multiplex desarrollado y validado en este estudio representa una herramienta diagnóstica sensible, específica y confiable para la detección de FeLV y FIV, con potencial de aplicación tanto en el ámbito clínico como en estudios epidemiológicos de poblaciones felinas urbanas.