La sífilis congénita (SC) es una infección sistémica causada por la espiroqueta Treponema pallidum subespecie pallidum, la cual genera graves complicaciones neonatales, convirtiéndola en un problema de salud pública en Colombia. El diagnóstico se basa en la detección de reaginas mediante pruebas no treponémicas, confirmadas con pruebas treponémicas en caso de reactividad. Sin embargo, estas pruebas presentan una eficacia limitada para diagnosticar la sífilis congénita, ya que poseen baja especificidad y requieren que los títulos en los neonatos sean cuatro veces mayores que los de la madre, con el riesgo de que estos títulos sean resultado del traspaso placentario de anticuerpos maternos. Con base en este contexto, en este análisis se evaluó la eficiencia y efectividad analítica de dos técnicas de biología molecular (qPCR Sybr Green /qPCR sonda TaqMan) a través de la detección de dos genes específicos de T. pallidum (polA y TpN47 respectivamente), mediante el montaje de curvas estándar y el análisis de 30 muestras de neonatos con sospecha de sífilis congénita, se obtuvo una eficiencia de 116.5% para Sybr Green y 168.65% para Sonda TaqMan, así mismo se alcanzó una sensibilidad de 1000 fg/uL y 0.01 fg/uL respectivamente. Los resultados mostraron valores similares en las características técnicas para las dos pruebas, mostrando su potencial en la detección del patógeno en muestras neonatales, sin embargo, la técnica qPCR TaqMan presentó una mayor sensibilidad analítica. Los resultados de esta investigación son fundamentales para el desarrollo de un protocolo de diagnóstico de sífilis congénita basado en técnicas de biología molecular.